2009-04-28 thèse de Anne-Laure Finoux

Transcription:

l’initiation de la transcription:

La synthèse d’un ARN pré-messager a lieu au cours de l’étape de transcription qui est très finement régulée. chez les eucaryotes, différentes ARN polyùérases existent et chacune d’entre elles est responsable de la synthèse d’ARN spécifiques. Ainsi, l’ARN polymérase I est responsable de la production de la majorité des ARN ribosomaux (ARNr), l’ARN polyméase III de la synthèse des ARN de transfert (ARNt), de l’ARNr 5S et d’autres petits ARN, et l’ARN polymérase II transcrit les ARNm, certains snRNA (small nuclear RNA), snoRNA (small nucleolar RNA) et les micro-ARN. La polymérase II représente le centre d’une machinerie complexes auquel viennent s’ajouter six facteurs de transcription généraux (TFII-A, -B, -D, -E, -F, -H) responsables de la reconnaissance du promoteur et du déroulement de l’ADN et un large complexe applelé médiateur impliqué dans la régulation de la transcription. Le coeur de l’ARN polymérase est constitué de douze sous-unités protéiques capable de synthétiser des molécules d’ARN et possédant une activité de correction des erreurs. Les promoteurs sont les lieux d’assemblage du complexe de préinitiation et sont constitués de régions constantes et de régions régulatrice. L’élément de base d’un promoteur est constitué d’une séquence TATA et/ou d’une séquence d’initiation (Inr) contenant le site de démarrage de la trascription et eput également contenir un troisième élément appelé DPE (downstream promoter element) situé en aval du site d’initiation. Les élém »nts régulateurs sont quant à eux spécifiques des gènes et localisés en amont du coeur du promoteur. Is incluelent des séquences activatrices (UAS: upsteam activation sequences) et inhibitrices (URS: upstream repression sequences) qui servent de sites de liaison pour les activateurs et inhibiteurs de la transcription. Chez la levure S. cerevisiae, les éléments TATA sont situés 40 à 120 nucléotides en amont du site d’initiation de la trascription et ont pour séquence consensus la séquence TATAAA. Ils représentent le site de liaison de la protéine TBP (TATA binding protein) qui est essentielle pour une initiation efficace et pour l’assemblage du complexe de transcription. Notons qu’il existe des promoteurs dépourvus de séquence TATA et dans ce cas, la transcription des gènes correspondants demeure dépendante de la fixation de TBP.

La régulation de la transcription s’effectue essentiellement au niveau de l’étape d’initiation. Il existe deux grands types de régulation transcriptionnelle chez les eucaryotes. D’une part, de façon générale, la structure de la chromatine ne permet pas l’accès de la polymérase au promoteur en raison de son organisation en nculéosomes. Ceux-ci représentent ainsi des répresseurs généreux de l’expression génique. Ce degré de régulation est corrélé aux différentes modifications post-traducctionnelles des queues des histones (méthylation, acétylation, phosphorylation, ubiquitination) qui permettent le recrutement d’enzymes de remodelage de la chromatine. Notons qu’il a récemment été mis en évidence que ces modifications existent également dans la région codante des gènes, régulant ainsi les différentes étapes de l’élongation de la transcription. D’autre part, la régulation transcriptionnelle requiert l’intégration d’informations provenant de facterus de transcriptions spécifiques liés aux séquences activatrices (UAS) régulées situées en amont du démarrage de la trascription. Cette intégration est réalisée par le médiateur qui représente un large complexe protéiques pontant l’ARN polymérase II et les nombreures protéines impliquées dans l’activation et la répression de la trascription. Ainsi, les facteurs de trascription liés à ces séquences interagissent directement avec le médiateur mais pas avec la polymérase. La polymérase II, les facteurs de transcription généraux et le médiateur forment un large complexe de 2.5 MDa qui s’assemble à chaque promoteru spécifique de la polyméarse II avant l’initiation.

Très tôt après l’initiation, et de façon concomitante à la transcription a lieu l’agout en 5′ d’une structure particulière importante pour l’ARN néoformé: la coiffe.

Couplage de la transcription et de l’ajout de la coiffe:

Au cours de l’étape de transcription, l’ARNm subit un certain nombre de modification. Les premières étapes de ces maturations sont physiquement et fonctionnellement couplées à la transcription. Le premier évènement est l’ajout en 5′ d’une structure particulière grâce à la machinerie d’addition de la coiffe. Ce complexe intervient très tôt au cours de la synthèse de  l’ARN puisque celui-ci ne fait alors qu’environ 22 à 25 nucléotides. Le recrutement de cette machinerieest réalisé par le domaine C-terminal de la grande sous-unité de l’ARN polymérase II -CTD) qui peut être considéré en partie comme une plate-forme assurant la liaison de nombreux facterus de maturation des ARN mais nous verrons également par la suite son implication directe dans le couplage de la transcription avec d’autres étapes de la maturation. Ce domaine comprend plusieurs répétititons d’un heptapeptide de séquence consensus YSPTSPS. Il peut adopter plusierus conformations de fçon dépendante de son état de phophorylation. Ainsi, la sérine 5 du CTD est phophorylée lorsque la transcription est initiée, puis la sérine 2 l’est au cours de l’étape d’élongation.

La réction d’ajout de la coiffe peut $etre divisée en trois étapes majeurs. D’une part une première enzyme élimine un phosphate de l’extrémité 5′ de l’ARNm. La réaction suivante correspond à l’ajout d’un résidu guanosine par une guanylytransférase via  son recrutement par le domaine CTD phophorylé au niveau de la sérine 5. L’enzyme est ensuite dissoicée de la polymérase et une troisième étape consistant en la méthylation de guanosine est réalisée par une N7G-méthyltransférase. L’ajout de la coiffeen 5′ au cours de la transcription est associé à uen pause de la machinerietranscriptionnelle. Différentes expériences ont ainsi suggéré qu ecette pause représentait un premier point de contrôle de l’ARN néo-synthétisé car il précède l’étape d’élongation par la polymérase qui n’aurait ainsi lieu  que si l’ARN est correctement coiffé. La coiffe est reconnue de façon co-transcriptionnelle dans le noyau par le complexe CBC constitué des protéines Cbp20 et Cbp80 qui lient respectivement la coiffe et le domaine CTD.

Couplage de la transcription et de l’épissage

L’épissage représente le deuxième événement de maturation des ARN pré-messagers. Les gènes eucaryotes sont pour la plupart constitués d’exons (séquences qui se retrouveront dans l’ARNm mature) et d’introns. Bien que la majorité des ARNmde la levure S. cerevisiae ne présentent pas ou peu d’intron, les mécanismes d’épissage ont été relativement bien conservés de la levure à l’homme.

Au cours de la réaction d’épissage, les introns présents dans le transcrit primaire sont excisés et les exons 5′ et 3′ ligués suite à deux étapes de transestérification réalisées par un complexe dynamique, le spliceosome, composé de ribonucléoprotéines: les U snRNP (uridine-riche small nculear ribonculeoproteins) et de nombreux facteurs non-snRNP. Chaque particule U snRNP est constituée d’une molécule U snRNA comexée à sept protéines Sm ou Sm-like ainsi qu’à d’autres protéines spécifiques. Ainsi, la majorité des introns présents dans les ARN pré-messager sont épissés par un spliceosome composé des U snRNP U1, U2, U4, U5, et U6. Les études concernant ce complexe ont été réalisées principalement in vitro et supportent l’hypothèse d’un assemblage dynamique et ordonné de celui-ci sur l’ARN pré-messager. La snRNP U1 s’associe en premier engageant le transcrit vers l’épissage. La snRNP U2 est ensuite ajoutée pour former le pré-splceosome qui est reconnu par un complexe pré-assemblé constitué des snRNP U4, U5 et U6. Différents réarrangements ont lieumenant à la dissociation de U1 et U4 et à la  formation d’un complexe d’épissage actif. Cet assemblage est principalement orchestrés 5’SS (splicing site), de point de branchement BP (branching point) et 3′ SS sont très bien conservées parmi les introns présents chez la levure. Ces études in vitro ont été réalisées à partird’ARNm synthétisés préalablement. Or, in vivo, les introns apparaissent à des temps distincts au cours de la transcription. Un assemblage différent du spliceosome in vivo a ainsi été discuté cependant les dernières études réalisées utilisent la technique d’immunoprécipitaion de la chromatine adaptée à l’ARN (CHIP: chromatine immunoprecipitation) tendent à démontrer un assemblage co-transcriptionnel séquentiel comme in vitro.

De plus, certains transcrits sont épissés de façon co-transcriptionnelle. Dans ce cas, on retrouve une implication du domaine CTD de l’ARN polymérase II puisque différentes données exprérimentales supportent l’hypothèse d’un rôle direct du domaine dans la reconnaissance de l’exon (exon recognition). Celui-ci interagirait avec des facteurs d’épissage mais il pourrait également permettre un rapprochement physique des différents exons d’un messager, facilitant ainsi l’assemblage du spliceosome. Il existe un certain nonbmre de différences entre les mécanismes d’épissage chez la levure et l’homme. Il est ainsi intéressant de noter que chez l’homme, un complexe est déposé en amont de la jonction exon/exon après épissage.

Couplage de la transcription et de la maturation de l’ARNm en 3′

La troisième étape de maturation des ARN primaires correspondant à l’ajout d’une queque poly(A) est réalisée de façon concomitante à la réaction de terminaison de la transcription. L’addition de la queque poly(A) est réalisée en deux étapes. L’ARN pré-messager est tout d’abord clivé environ 20 à 30 bases en aval d’un site signal puis est polyadénylé. La maturation d’un ARNm en 3′ peut être reconstituée in vitro avec plusieurs complexes multimériques: CFIA (cleavage factor IA), CFIB (cleavage factor IB) et CPF (cleavage and polyadenylation factor) chez la levure S.cerevisiae. Le premier complexe est constitué de quatre sous-unités, le second d’une protéine alors que le troisième est composé d’au moins quinze facteurs, incluant l’enzyme Pap1 (Poly(A) polymerase) responsable à l’ajout de la queque poly(A) au niveau de l’extrémité clivée 3′-(OH). Les ARNm possèdent une queue poly(A) de taille bien définie puisqu’elle fait en moyenne 70 nucléotides chez lalevure et 250 nucléotides chez l’homme. L’une des questions non élucidées concernant ce processus est de comprendre le mécanisme par lequel la taille de la queue poly(A) est définie. Chez l’homme, il a en effet été établi que l’étape contôlée est la synthèse par un mécanisme permettant une mesure de la taille de la queue poly(A). La réaction de polyadénylation est processive mais une fois la taille de 250 résidus (A) atteint, elle devient distributive et la réaction de polyadénylation est achevée.

Deux hypothèse existent à l »heure actuelle pour la levure. Il a été suggéré que la protéine Pab1 (Poly(A) binding protein) pouvait stimuler la nculéase PAN (poly(A) nuclase), spécifique des résidus (A), pour éliminer l’excès de (A) en digérant l’extrémité 3′. La protéine Pap1 (Pab1 binding protein) qui interagit avec la protéine Pab1 aurait quant à elle un effet négatif sur l’activité du complexe PAN. Cette première hypothèse consisterait ainsi en un mécanisme résultant d’un équilibre entre synthèse et dégradation de la queue poly(A). La deuxième hypothèse implique la protéine Nab2 (Nuclear polyadenylated RNA-binding 2) qui serait responsable d’un contrôle direct de la synthèse de la queue poly(A) comme ceci a été démontré chez les mammifères.

Finalement, il est intéressant de noter que le recrutement des facteurs de clivage est initié dès la reconnaissance du promoteur et que celui-ci est progressif tout le long du gène. Les protéines sont ainsi présentes en forte concentration en 3′ du messager. Ceci peut s’expliquier par différents phénomènes. D’une part, en raison de l’affinité de ces protéinespour l’ARN, on retrouve plus de facterus associés lorsque la taille de cluièci augmente au cours de la synthèse. D’autre part, ces protéines reconnaissent une forme particulière du domaine CTD de la polymérase II qui est phosphorylé au niveau de la sérine 2, modification qui a lieu au cours de l’étape d’élongation. Enfin, il existe une forte spécificité entre les otéines impliquées dans la maturation 3′ de l’ARN pré-messager et le site de polyadénylation. La concentration de ces facterus en 3′ est également ssentielle pour la terminaison de la transcription. Le clivage génère ainsi deux molécules d’ARN. L’ARN possédant la coifffe est polyadénylé alors que l’ARN présentant une extrémité 5′-monophosphate est dégradé rapidement par l’enzyme Rat1. Deux modèles non exclusifs co-existent concernant la terminaison de la transcription. Le premier modèle, appelé <anti-terminateur>, propose que l’apparition des séquences de polyadénylation sur l’ARN en cours de synthèse de maturation de l’extrémité 3′ pourrait éliminer un facteur d’élongation ou bien recruter un facteur de terminaison. L’ARN polyméraseII étant alros moins processive, celle-ci se dissocierait de l’ARN et achèverait ainsi la synthèse du messager. Le deuxième modèle, appelé <toredo>, propose que l’enzyme Rat1 dégraderait l’ARN possédant l’extrémité 5′ mono-phosphate mais ciblerait également la terminaison de la transcription en provoquant la dissaciation de l’ARN polymérase II.

Traduction des ARNm

Au cours de l’initiation, la coiffe recrute la petite sous-unité ribosomale et la grande sous-unité est asemblée au niveau du codon initiateur de l’ARNm avec un ARN de transfert spécifiant une méthionine présent dans sont site peptidyl (P). Durant l’élongation, les ARNt aminoacyls entrent au niveau  du site accepteur (A pour aminoccyl) où le décodage prend place. Si l’ARNt est reconnu comme correct, le ribosome catalyse la formation d’un lien peptidique. L’ARNt déacylé et l’ARNt lié à la chaîne peptidique sont ensuite transloqués respectivement vers le site (E) pour (pour exit) et (P) et le codon suivant se retrouveainsi au niveau du site (A). Ce mécanisme est répété jusqu’à l’étape de terminaison qui a lieu lorsque le ribosome rencontre un codon stop. Le peptidefinal est ensuite libéré du ribosome. Les sous-unités ribosomales et les ARNt déacylés sont ensuite dissociés au cours de l’étape de recyclage pour être réutilisés pour un autre cycle de traduction.

Initiation de la traduction:

Assemblage du complexe d’initiation:

La première étape de l’initiation de la traduction correspond à l’assemblage d’un complexe ternaire entre eIF2, une molécule de GTP et un ARNt intiateur (ARNti) spécifiant une méthionine (Met): eIF2-GTP-ARNti_Met. Le facteur eIF2 chargé d’une molécuel de GTP est généré au cours d’une réaction échangeant GDP et GTP catalysée par eIF2B. Cette liaison est stabilisée uniquement quand l’ARNti_Met se lie à eIF2. Après sa formation, le complexe ternaire se lie à la petite sous-unité ribosomale (40S) pour se fixer à l’ARNm à traduire. eIF4E est la protéine cytoplasmique de liaison à la coiffe et l’association de cette protéine à l’ARNm joue  un rôle essentiel au cours de l’initiation de la traduction.  Elle existe en effet avec la protéine eIF4G au sein du complexe d’initaition eIF4F qui a poru rôle d’ancrer le complexe ternaire au ribosome. Cette liaison est admise comme étant l’étape limitante pour l’initiation de la traduction et est donc soumise à une régulation précise. Nous pouvons ainsi noter que l’initiation des protéine eIF4E et eIF4FG augemente fortement l’affinité d’eIF4E pour la coiffe indiquant certainement leur association avant toue interaction des protéines avec l’ANRm coiffé. La protéine eIF4G joueun rôle central au cours de la liaison de l’ARNm au ribosome. Chez les mammifères, elle est considérée comme une plate-forme adaptatrice puiqu’elle ponte eIF4E et eIF4F respectivement via ses extrémités N et C-terminale. Cette protéine possède en effet plusieurs domaines lui permettant d’interagir avec eIF4E, eIF4F, Pab1 et eIF3 qui est considérée comme une portéine adaptatrice pour le recrutement de l’ARN. En revanche, chez la levure, eIF3 ne lie pas directement la protéine eIF4G mais indirectment grâce à la protéine eIF5. Ainsi, un complexe composé des protéines eIF1, eIF3 et eIF5 permet l’ancrage entre eIF4G et la petite sous-unité ribosomale et ainsi la liaison du complexe ternaire à l’ARNm pour former le complexe 43S. Un complexe constitué des facteurs eIF1, eIF2, eIF3, iIF5 et de l’ARNti-Met a en effet été isolé chez la levure suggérant que la liaison de l’ARNt initiateur à la sous-unité 40S est accomplie suite au pré-assemblage d’un complexe multifactoriel.

L’extrémité 3′ est également essentielle au recrutement de l’ARNm sur la petite sous-unité par l’action conjointe de la queue poly(A) et de la protéine Pab1. La protéine Pab1 se lie le long de la queue poly(A) grâce à quatre domaine RRM (RNA recognition motifs). La structure de la protéine Pab1 a permis de déterminer que le domaine RRM2 contient des sites de liaison pour la protéine eIF4G qui se situent sur la partie opposée à la région liant l’ARN. Cette observation a permis de proposer que cette interaction circularise les ARNm. L’effet de l’interaction entre Pab1 et eIF4F est d’augementer l’efficacité du recrutement du complexe 43S sur l’ARNm. Les effets de la coiffe et de la queue poly(A) ne sont pas additifs mais synergiques in vivo. Ainsi, la queue poly(A) n’est pas suffisante au recrutement du complexe43S. En effet la coiffeest essentielle car elle permet de recruter la petite sous-unité et d’initier la traduction au bon AUG.

Sélection du codon d’initiation AUG:

Le complexe de pré-initiation (48S) recherche par la suite le codon AUG correct. Un mécanisme appelé balayage a été proposé consistant en la progression de la petite sous-unité ribosomale le long de la région 5′-UTR jusqu’au codon initiateur. Ce processus implique la protéine eIF4A qui possède une activité ATPase dépendante de l’ARN capable de dérouler des structures d’ARN in vitro de mnière peu processive. Il s’agit d’un membre de la famille des hélicases à boîte DEAD. L’incorporation d’eIF4A au sein du complexe eIF4F stimule son activité ainsique la protéine eIF4B qui affecte son affinité pour l’ARN et pour l’ATP. Le modèle actuel propose que la protéine peut interagir avec des duplexes d’ARN dans sa conformation liée à l’ATP et que suite à son hydrolyse, elle détruit certains appariements au sein de l’hélice. L’action d’eIF4A est ainsi de dérouler les structures présentes dans la région 5′-UTR assistée de la protéine eIF4B afin de créer un ARN simple brin permettant la liaison du ribosme. Ainsi, le rôle du complexe eIF4F est vraisemblablement de recruter la protéine eIF4A, responsable du déroulement des structures de la région 5′-UTR bien que celle-ci n’appartienne pas directement au complexe eIF4F chez la levure. De plus, nous avons vu qu’il amène le facteur eIF3 qui joue un rôle dans le recrutement du complexe 49S à l’ARNm.

Dest études génétiques ont permis de démonter l’implication des facteurs eIF2, eIF1 et eIF5 dans la reconnaissance du site de démarage AUG et de façon intéressante des liens physiques existent entre ces protéines. Un appariement correct entre le codon AUG et l’anticodon ARNti_Met engendre l’hydrolyse du GTP lié à eIF2 au cours d’une réaction impliquant la protéine eIF5. La protéine eIF5 est une protéine capable d’induire une activité GTPase (GAP: GTPase activation protein) qui est active uniquement lorsque le complexe ternaire est lié au complexe d’initiation. Il a par ailleurs été démontré que la protéine est inactive lorsque le complexe 40S est lié aux factereurs eIF1, eIF1A, eIF3 et eIF5. En revanche, le positionnement ldu complexe au niveau du codon AUG en présence d’eIF5A, eIF4B  et d’ATP rstaure l’hydrolyse du GTP par eIF5. Ceci est probablement le résultat d’un remodelage des interactions entre les différents facterus d’initiation suite à un changement de conformation du comolexe ou bien le résultat du départ de facteurs impliquant un rapprochement physique des protéines eIF5 et eIF2.

Suite à l’hydrolyse du GTP, la sous-unité 60S rejoint la petite sous-unité pour former le complexe 80S qui peut alors débuter la formation de lien peptidique entre la methionine et le second acide aminé codé.

Elongation de la traduction:

est une étape très bien conservée contrairement à l’étape d’initiation. Lorsque l’élonation de la traduction débute, un ARNt-aminoacyl se situe dans le site P du ribosme, le site A étant vide. La première étape de l’élongation de la traduction débute avec la formation d’un complexe ternaire entre le facterur d’élongation eEF1A (eukaryotic elongation factor 1A), une molécule de GTP et un ARNt-aminoacyl. Le facteur hétérotrimérique eEF1B catalyse l’échange GDP/GTP sur eEF1A. Ce complexe se lie au site A du ribosme où une vérification s’opère afin de déterminer si l’anticodon de l’ARNt correspond au codon présent au site A. Cette vérification implique de nombreuses étapes telles que l’appariement codon/anticodon, des changements conformaitonnels au sein du cnetre de décodage de la petite sous-unité ribosomale et l’hydrolyse du GTP par eEF1A. Le facteur eEF1A lié au GDP est relargué du ribosome où il laisse l’ARNt-aminoacyl dans le site A qui bascule vers le centre peptidyl transferase du ribosome au cours d’une étape appelé accommodation.

La formation d’un lien peptidique entre l’acide aminé arrivant et l’ARNt portant la chaîne peptidique est ensuite assuré. LARNt ainsi déacylé est déplacé du site P au site E pendant que l’ARNt lié à la chaîne peptidique est déplacé du site A au site P. Cette étape appelée translocation implique la protéine G eEF2 qui hydrolyse alors une molécule de GTP. Le résultat de cette opération  est le retour à l’étape initiale avec un ARNt-peptidyl au niveau du site P et le site A vide. L’ensemble du processus décrit est répété jusqu’à ce que le ribosome rencontre un codon stop et initie le processus de terminaison.

Un facteur supplémentaire est nécessaire à la traduction chez la levure et les champignons: le facteur eEF3. eEF3 stimule la liaison de l’ARNt-aminoacyl correct par eEF1A au site A. De plus, il contrôle également l’élimination de l’ARNt déacylé pour faciliter la liaison du complexe ternaire contenant l’ARNt-aminoacyl correct au site A. Il a été montré que eEF3 lie le facteur eEF1A in vitro, cependant son rôle exact au cours de l’élongation n’est pas connu.

Terminaison de la traduction:

Les codons stops rencontrés au cours de l’élongation sont reconnus par un hétérodimère constitué des facteurs eRF1 et eRF3. La cellule ne possède pas en effet d’ARNt capables de reconnaître les codons stops. Les facteurs RF (release factor) de classe 1 à laquelle appartient eRF1 ont été découverts en premier et leur fonction est de trasmettre le singal de la présence d’un codon stop occupant le site A du ribosome au centre peptidyl-transferase. Les troiscodons stops eucaryotes sont reconnus par eRF1 uniquement, contrairement aux procaryotes qui nécessitent deux facteurs. De façon surprenante, les propriété possède plusieurs domaine distincts dont les repliements et dimentsions sont comparables à ceux d’un ARNt. Le domaine N-termianl qui est impliqué dans la liaison au codon stop correspond ainsi au bras de l’anticodon, le domaine central à la tige liant l’acide aminé et le domaine C-terminal à la boucle variable de l’ARNt. Chaque domaine est distinct et conserve ainsi une possibilité de contraintes stériques au sein du site A du ribosome. Un petit domaine a été identifié car celui-ci est très bien conservé. Il s’agit du domaine Gly-Gly-Gln (ou GGQ) dont le rôle est essentiel au cours de la terminaison de la traduction. Les mutants construits ne sont en effet plus capable d’induire l’hydrolyse de l’ARNt-peptidyl alors qu’ils lient toujours le ribosome. Ce domaine n’est pas impliqué dans la reconnaissance du codon stop mais permet vraisemblablement d’interagir avec l’ARt-peptidyl dans le centre peptidyl-transferase du ribosome pour transmettre le signal de la présence du codon stop au centre catalytic et induire l’hydrolyse de l’ARNt-peptidyl.

Une deuxième classe de facteurs RF a été identifiée à laquelle appartient le deuxième facteur de terminaison euaryote: eRF3. Ce facteur possède une activité GTPase qui induit la conversion du GTP en GDP à l’intérieur du ribosome. Contrairement à son homologue procaryote, ce facteur nécessite la présence d’eRF1 pour son activité GTPase et les deux facteurs forment un complexe stable in vivo et in vitro. De façon intéressante, l’interaction est indépendante de l’activité d’eRF1 puisque des mutants de cette protéine sont capables d’activer eRF3. L’activité GTPAse d’eRF3 couplerait la reconnaissance des signaux de terminaison à la libération de la chaîne polypeptidique. L’un des derniers modèles proposés concernant le rôle d’eRF3 au cours de la terminaison est que l’activité GTPase d’eRF3 assiste le facteur eRF1 dans la reconnaissance du codon stop. L’interaction stable entre eRF1 et le site A stimulerait l’hydrolyse du GTP par eRF3. Un changement de conformation pourrait alors s’opérer et permettrrait l’induction de la libération de la chaîne peptidique.

Dégradation des ARNm

Cinq voies de dégradation ont été découvertes chez la levure S. cerevisiae: deux voies dedégradation des ARNm dits <normaux> appelées voies 5′-3′ et 3′-5′ et trois voies de dégradation d’ARNm dits <aberrants> appelées NMD (nonsense mediated deaay), NSD (nonstop decay) et NGD (no-go dacay).

Voie de dégradation 5′-3′:

a été ddéfiniecomme étant la voie majeure de dégradation des ARNm chez la levure S.cerevisiae. Celle-ci peut se diviser en trois grandes étapes. L’ARNm est tout d’abord déandénylé par un complexe constitué des protéines Pop2/Ccr4 jusqu’à ce que la queue poly(A) ne mesure plus que 10 à 15 résidus. Cette étape induit par un mécanisme inconnu le clivage de la coiffe réalisé par le complexe Dcp1/Dcp2 qui libère une extrémité 5′-monophophate, substrat de l’enzyme Xrn1, qui dégrade l’ARNm dans la direction 5′-3′.

Déadénylation:

Un rôle de la queue poly(A) dans la stabilité des ARNm a été proposé très tôt  faisant suite à l’observation que les queues poly(A) des ARNm subissent une diminution progressive de leur taille dans le cytoplasme. Il a ainsi été proposé que les queues poly(A) stabilisent les ARNmqui seraient dégradés lorsque celle-ci est diminuée.

Différentes observations ont permis d’établir que la déadénylation était l’étape limitante au cours de la dégradation des ARNm. Ainsi, par des expériences d’induction suivie d’une chasse transcriptionnelle (pulse chase), il a été possbile d’observer la dégradation d’une population homogène d’un ARNm spécifique. Suite à l’arrêt de la transcription de chaque ARN rapporteur testé, un délai variable précédant leur dégradation a pu être mesuré. De façon intéressante, pour les transcrits testés, ce délai est corrélé au temps de leur déadénylation. Cette première observation a suggéré que la déadénylation était une étape requise pour la dégradation des transcrits étudiés et a ainsi démontré son importance. La dégradation de la queue poly(A) n’est pas totale dans un premier temps puisqu’un oligo(A) d’environ 10 à 15 nucléotides demeure à l’issue de cette étape.

Le premier compelxe découvert comme participant à la dégradation de la queue poly(A) chez la levure est le complexe PAN. L’activité de ce complexe est portée par un hétérodimères: Pan2/Pan3. Pan2, la sous-unité catalytique de ce complexe, est un membre de la famille des exonucléases 3′-5′ portant un domaine RNaseD. De façon surprenante, les souches délétées pour le gène PAN2 ou PAN3 ou les 2 sont viable et l’activité déadénylase est epu affectée in vivo, suggérant l’existence d’uatres nucléases responsables de la déadénylation. Identifiée en premier lieu dans des cellules de mammifères, la déadényolase PARN est requise au cours de la maturation des oocytes de xénope et dans des extraits de cellules Hela. Cependant, aucun homologue de cette protéine n’a été découvert chez la levure ou chez la drosophile.

La recherche de nouvelles déadénylases a permis d’identifier le complexe possédant l’activité majeure chez la levure, le complexe Pop2/Ccr4. Différentes observations ont permis sa mise en évidence. Ces protéines appartiennent à deux complexes de 0.9 et 1.9 MDa incluant 5 protéines Not, identifiés comme facteur de transcription car la délétion de chacun de ces gènes engendre une variation des niveaux d’ARNm à l’état stationaire? Une recherche d’homologue du gène humain PARN par alignement de séquences a permis de déterminer que le gène POP2 possède une signature RNaseD tout comme PARN ou PAN2. Ccr4 contient 3 domaines majeurs. Le deuxième domaine est constitué de 5 copies en tandem ‘une séquence répétée riche en leucine (LRR pour leucine-rich repeat) qui est essentiel our son interaction avec la protéine Pop2. Le domaine C-terminal correspond quant à lui à un domaine nucléasede la famille des endonucléases dépendantes du magnésium. De plus, ces deux protéines interagissent avec le facteur Dhh1 impliqué dans la régulation du clivage de la coiffe, étape essentiellem au cours de la dégradation. Les analyses réalisées à l’aide de souches délétées pour le gène POP2 ou CCR4 ont clairment montré l’implication des protéines correspondantes dans la dégradation des ARNm. Les demi-vies d’ARNm rapporteurs stables et instables sont en effet augemntées dans de telles souches. Des expériences d’induction suivie d’une chasse transcriptionnelle ont démontré que ces protéines sont impliquées dans l’étape de déadénylation car la diminution de la queue poly(A) est affectée et imcomplète dans ces souches. Une activité déadénylase résiduelle est cependant présente malgré la délétion de ce complexe. La délétion du gène PAN2 dans une souche délétée pour CCR4 a permis d’établir que cette déadénylation résituelle pouvait être attribuée à l’activité du coplexe PAN. Dans cette souche, les transcrits rapporteurs ne présentent aucune diminution signigicative de la taille de leur queue poly(A) et sont très stables.La viabilité deces soches indique qu’une dégradation des ARNmrésiduelle doit se produire de façon indépendante de la déadénylation. Un défaut d’activité de clivage de la coiffe et de l’activité exolncuoléase 3′-5′ mènent en effet à la mort cellulaire. De plus, l’intermédiaire de dégradation caractéristique de la voie 5′-3′ est présent dans les souches délétées pour POP2, CCR4ou CCR4/PAN2 mais son apparition a lieuplus tard et à un niveau très inférieur à la souche sauvage. Ainsi, ladégradation des ARNm semble se produire de façon indépendante de la déadénylation, activant vraisemblablement un clivage de la coiffe et une dégradation 5′-3′ compte tenu des intermédiareis détectés. Toutes ces observations ont permis de démontrer que le complexe Pop2/Ccr4 était la déadénylase majeure chez S. cerevisiae mais sa mise en évidence a ensuite soulevé la question de la protéine possédant l’activité catalytique in vivo. En effet, à l’issue de ces expéreinces, on peut se demander si ces deux protéines qui interagissent fortemen t possèdent toutes les deux des domaines nucléase actifs in vivo. Deux équopes indépendantes ont finalment mis en évidence qu eCcr4 portait l’activité catalytique dans ce complexe de déadénylation. Afin de déterminer l’importance du domaine nucléase de Ccr4, 4 mutations ont été réalisées parmi les résidus les plus conservés du domaine catalytique putatif. Ces quatre mutants interagissent toujours avec Pop2 mais affectent fortement la physiologie de la cellule qinsi que la stabilité des messagers testés in vivo. La purificatin de la protéine sauvage de levure ainsi que des protéines de souches mutantes a permis de tester leurs activités enzymatiques in vitro. les résultats obtenus ont démontré que la protéines Ccr4 possédait une activité poly(A) exoribonucléase 3′-5’. De plus, la protéine purifiée à partir d’une souche délétée por le gène POP2 présente les m^mes caractéristiques, suggérant que Pop!é n »est pas requise pour son activité. Finalement, la surexpression de la protéine Ccr4 supprime les défauts de croissance et dedéadénylation observés dans une souche délétée pour POP2. De même, la surexpression de Ccr4 dans un contexte sauvage augmente la vitesse de déadénylation des transcrits rapporteurs. Ces mêmes études ont suggéré un rôle des protéines Not associées au complexe Pop2/Ccr4 car les mutations dans les ègnes correspondants engendrenet des défauts de déadénylation. Il est cependant intéressant de noter que l’expressin d’un fragment correspondant au domaine RNaseD de la proteins Pop2 dans E. coli a permis de démontrer l’activité déadényalse de cette protéine, indiquant que Pop2 possède un domaine nucléase fonctionnel. Des analyses de compétitin à l’aide de différents substrats (poly(C), poly(G), poly(A)) a finalmenet établit la préférence de la protéine pour un substrat detype poly(A). Enfin, la structure de la protéine Pop2 a démontré que celle-ci possédait les caractéristiques d’une nucléase. Cependant, il est difficle d’établir son rôle in vivo. Une hypothèse est que la fonction de la protéine est régulée en fonction des conditions de croissnce. En effet, celle-ci est phophorylée maoritairement par le kinase Yak1 en phase stationnaire. Une seconde hypothèse est que la protéine stabilise les interactions du complexe avec l’ARN ou bien que celle-ci est requise pour un adressage correct du substrat à Ccr4.

Voie de dégradation des ARNm aberrants

Il existe ainsi un mécanisme spécifique des ARNm présentant un codon stop précoce, le NMD (nonsense mediated decay), qui permet l’élimination d’ARNm pouvant conduire à la synth_se de protéine tronquées. Il existe également un mécanisme spécifique des ARNm ne présentant pas de codon stop, le NSD (nonstop dacay) qui permet l’élimination d’ARNm pouvant conduire à la synthèse de protéine trp grandes. Finalement, une voie de dégradation (NGD (No-go decay)) des ARNm dont la traduction est bloquée au cours de l’étape d’élongation a été mise en évidence. On comprend aisément qu’il est important pour la cellule d’éliminer ces ARNm aberrants pour d’une part prévenir les effets délétères de ces protéines anormales sur la cellule et d’autre par éviter une utilisation inutile de la machinerie traductionnelle.

Nonsense-mediated decay:NMD